Budesonid – wielokierunkowy glikokortykosteroid w terapii chorób zapalnych

Czym jest BUD i jak działa na poziomie molekularnym?

Budesonid (BUD) to syntetyczny glikokortykosteroid (GC) niebędący pochodną halogenową, który odgrywa istotną rolę w odpowiedzi organizmu na stres. Wprowadzony we wczesnych latach 80. do leczenia astmy oskrzelowej, został uznany przez Światową Organizację Zdrowia za lek niezbędny w terapii przewlekłych chorób zapalnych, szczególnie tych dotyczących układu oddechowego (zapalenie błony śluzowej nosa, krtani, astma) oraz przewodu pokarmowego (zapalenie przełyku, żołądka, jelita grubego). Najnowsze badania wskazują, że oprócz dobrze poznanych właściwości przeciwzapalnych, BUD wpływa również na plastyczność komórek macierzystych, przerzutowanie komórek nowotworowych oraz replikację wirusów RNA o dodatniej polarności.

Pod względem struktury chemicznej, BUD (C25H34O6, masa cząsteczkowa: 430,53 g/mol) posiada trzy reszty wspólne z kortyzolem: keton, hydroksyl i resztę 2-hydroksyacetylową zlokalizowane odpowiednio w pozycjach 3, 11 i 17 podstawowego czteropierścieniowego szkieletu steroidowego. BUD różni się od typowych GC (takich jak hydrokortyzon, prednizolon i deksametazon) ze względu na swoją strukturę pentacykliczną (butylideno-bis-oksy) zlokalizowaną w pozycjach 16 i 17 szkieletu steroidowego. W konsekwencji BUD jest mniej rozpuszczalny w wodzie (46 vs 320 μg/ml) niż hydrokortyzon, wykazuje 200-krotnie większe powinowactwo do receptorów glikokortykosteroidowych oraz silną aktywność glikokortykosteroidową przy słabej aktywności mineralokortykosteroidowej.

BUD jest preferowany w stosunku do innych kortykosteroidów ze względu na jego ekstensywny (>80%) metabolizm pierwszego przejścia przez wątrobę za pośrednictwem aktywności enzymu cytochromu P450/CYP3A, niską potencję metabolitów pochodnych (16α-OH-prednizolon i 6β-OH-BUD) oraz funkcję substratu dla pompy usuwania leków P-glikoproteiny. Te szczególne cechy przyczyniają się do jego niskiej biodostępności ogólnoustrojowej i minimalnych działań niepożądanych wynikających z supresji osi podwzgórze-przysadka-nadnercza. Przykładowo, 6 godzin po inhalacji pojedynczej dawki (1600 μg) BUD, stężenie w surowicy osiąga zaledwie 1 nM.

Jakie innowacje i mechanizmy kryją się za działaniem BUD?

BUD zwykle tworzy kompleks z cząsteczkami wzmacniającymi rozpuszczalność, takimi jak hydroksypropylo-β-cyklodekstryna (stożkowy cykliczny oligosacharyd), który jest w stanie pomieścić hydrofobowe steroidy. Opracowano szereg innowacyjnych nośników dla BUD, w tym nanocząsteczki liposomalne (nazywane budsomami) z BUD połączonym z kwasem linolowym poprzez wiązanie estrowe hydrolizujące, micele o rozmiarach nanometrycznych utworzone przez sprzężenie kwasu stearynowego z kwasem kawowym (związek amfifilowy), hydrożele biodegradowalne pektynowe/poliakryloamidowe, nanocząsteczki kwasu hialuronowego, kwas polilaktydowo-ko-glikolidowy i nanocząsteczki dl-polilaktydowe, pegylowane liposomy, mezoporowate nanocząsteczki krzemionkowe, pęcherzyki i nanocząsteczki oparte na kwasach żółciowych, biokrezemionkowe mikrocząsteczki diatomitowe oraz manozylowane nanocząsteczki palmitynianu BUD. Nanocząsteczki zawierające BUD (średnica 57 nm) włączone do hydrożeli i hydrożeli poloksamerowych zostały wygenerowane do leczenia atopowego zapalenia skóry. Kapsułki zaprojektowano tak, aby uwalniały BUD w dystalnym odcinku jelita krętego/okrężnicy (formulacja o ukierunkowanym uwalnianiu) w leczeniu nefropatii IgA. Dostępne są również czopki zawierające BUD, produkowane metodą druku 3D wspomaganego ekstruzją półstałą, do leczenia zapalenia okrężnicy.

Randomizowane badanie z podwójnie ślepą próbą przeprowadzone na zdrowych ochotnikach wykazało, że po pojedynczej dawce wziewnej (320 μg, dzień 1) BUD, maksymalne stężenie w osoczu (Cmax = 459 pg/ml) zostało osiągnięte w mniej niż 1 godzinę (tmax = 0,3 h), a okres półtrwania (t1/2) BUD wynosił ~4,6 h. Ponadto, badanie zaprojektowane w celu oceny ekspozycji ogólnoustrojowej pacjentów pediatrycznych z eozynofilowym zapaleniem przełyku (EoE) na pojedynczą dawkę zawiesiny doustnej BUD (0,35-2 mg) rano wykazało porównywalne wartości między pacjentami (Cmax = 492 do 1019 pg/ml; tmax = 0,7 do 1,1 h; t1/2 = 3,3 do 3,5 h). Znacząca frakcja (>80%) BUD jest przekształcana w wątrobie w dwa główne i nieaktywne metabolity: 6β-OH-BUD i 16α-OH-prednizolon, przez aktywność enzymu CYP3A. Konwersja BUD w wątrobie zmniejsza ekspozycję ogólnoustrojową i zapobiega jakiejkolwiek istotnej akumulacji BUD. Częstość niepożądanych reakcji na leki po leczeniu BUD jest niższa niż w przypadku konwencjonalnych steroidów, a podawanie BUD poprzez inhalację dodatkowo zmniejsza ryzyko ekspozycji ogólnoustrojowej.

Podobnie jak klasyczne GC, BUD wiąże się z receptorem glikokortykosteroidowym N3CR1, członkiem nadrodziny receptorów jądrowych zależnych od ligandów czynników transkrypcyjnych, i modyfikuje profil transkrypcyjny komórek docelowych. W eksplantach ludzkiej tkanki płucnej płodu, BUD (30 nM, 4 dni) zmieniał ekspresję około 1000 genów związanych ze szlakami zapalnymi (np. interleukina 1β/IL1β, lipopolisacharyd), transformującym czynnikiem wzrostu-β1/TGFβ1 i czynnikiem martwicy nowotworu/TNF. Ponadto, w komórkach mięśni gładkich dróg oddechowych (ASM) pochodzących od pacjentów z astmą, BUD (100 nM, 24 h) powodował deregulację dużego zestawu genów (>5 × 103) zaangażowanych w szlaki zapalne/związane z cytokinami, metabolizm aminokwasów i lipidów, adhezję ogniskową i połączenia szczelinowe. BUD indukował produkcję cAMP w sposób niezależny od GR poprzez aktywację receptora sprzężonego z białkiem G Gα w pierwotnych ludzkich komórkach ASM i hamował zarówno skurcze indukowane histaminą w komórkach ASM świnki morskiej, jak i produkcję cytokin/chemokin prozapalnych z ludzkich makrofagów płucnych aktywowanych przez wydzielnicze fosfolipazy A(2)sPLA(2). BUD hamował translokację rzęskową Smoothened (Smo) i sygnalizację Hedgehog w komórkach NIH3T3 oraz promował mielinizację in vitro. Istnieją również pewne dowody na działanie mechanizmów epigenetycznych, ponieważ BUD indukował metylację DNA w fibroblastach izolowanych z chomika, gdy był podawany w bardzo wysokich stężeniach (50-70 μM).

Czy BUD skutecznie leczy przewlekłe choroby zapalne?

U pacjentów z przewlekłymi chorobami zapalnymi normalna ściśle upakowana struktura błony śluzowej zamienia się w zdezorganizowaną (rozluźnioną i luźną) tkankę, która jest atakowana przez komórki odpornościowe, takie jak limfocyty, eozynofile, komórki tuczne, neutrofile i makrofagi. Powszechnie przyjmuje się, że BUD wywiera silny zależny od GR efekt przeciwzapalny, który hamuje ekspresję mediatorów zapalnych (cytokin, eikozanoidów, histaminy i leukotrienów) oraz aktywację/migrację komórek odpornościowych. Jednak nowe dowody wskazują, że BUD wpływa również na komórki nabłonkowe na poziomie molekularnym (w zakresie profilu ekspresji genów i metabolizmu) oraz behawioralnym (w zakresie tempa wzrostu i zdolności adhezyjnej).

W eozynofilowym zapaleniu przełyku (EoE), przewlekłym zaburzeniu przełyku związanym z limfocytami T pomocniczymi typu 2, o szacowanej zapadalności 1-20 nowych przypadków na 100 000 mieszkańców rocznie i stosunku mężczyzn do kobiet 3:1, miejscowe leczenie BUD (zawiesina doustna, 2 mg dwa razy dziennie) jest preferowanym leczeniem. Cechy genetyczne i narażenie na kwas, alergeny pokarmowe lub aeroalergeny są uważane za czynniki przyczynowe EoE. Podczas gdy eozynofile są zwykle nieobecne w zdrowej błonie śluzowej przełyku, w błonie śluzowej EoE eozynofile przenikają przez nierogowaciejący nabłonek wielowarstwowy płaski i powodują eozynofilię przełyku (próg = 15 do 16 eozynofilów/pole o dużej mocy, ~0,3 mm2). Ponadto, normalna błona śluzowa jest zastępowana przez hiperplastyczny nabłonek z rozszerzonymi przestrzeniami międzykomórkowymi (powodującymi upośledzoną funkcję bariery) i zwłókniałą blaszką właściwą. W błonie śluzowej EoE prawie 5000 genów ulega deregulacji, a ich część jest związana z funkcją/integralnością nabłonka. W szczególności, ciężkość EoE (na podstawie obecności przełyku o wąskim kalibrze i hiperplazji strefy podstawnej) jest bardziej ściśle związana z deregulacją genów związanych z nabłonkiem (np. ACPP, CITED2, CTNNAL1, EML1, FLG, GRPEL2, MT1M, PNLIPPR3 i TSPAN12) niż ze stopniem inwazji eozynofilowej. W szczególności, badanie asocjacyjne całego genomu ujawniło obecność związku między genem DSG1 (kodującym desmogleinę-1 kadherynę desmosomalną, cząsteczkę adhezji międzykomórkowej) a ryzykiem EoE. W błonie śluzowej EoE, BUD zmienia ekspresję kornifin naskórkowych (np. SPRR1A, 2A, 2B i 2D) i enzymów transglutaminazy (TGM1 i TGM3), które są potężnymi modyfikatorami macierzy okołokomórkowej. Ponadto, remisja EoE wywołana przez BUD była związana z przywróceniem normalnego fenotypu nabłonkowego. Podobnie, BUD był w stanie przywrócić integralność bariery w modelu komórkowym eozynofilowego przewlekłego zapalenia błony śluzowej nosa z polipami nosa (eos-CRSwNP) leczonego cząstkami stałymi 2,5 (PM2.5).

W wrzodziejącym zapaleniu jelita grubego (UC), przewlekłej idiopatycznej chorobie zapalnej, która dotyka okrężnicy i wykazuje rosnącą światową częstość występowania, z częstością 10-20 na 100 000 osób, nawracającym i remitującym przebiegiem oraz wyższą częstością występowania u kobiet w wieku 20-30 lat, BUD (9 mg raz dziennie, 8 tygodni) jest typowo stosowany jako terapia pierwszego rzutu w leczeniu łagodnego/umiarkowanego UC. UC jest związane z infiltracją makrofagów i komórek dendrytycznych do blaszki właściwej. W mysim modelu zapalenia okrężnicy wywołanego siarczanem dekstranu sodowego, BUD hamował ekspresję cytokin (np. mieloperoksydazy/MPO i czynnika martwicy nowotworu/TNF-α) i enzymów zapalnych (np. cyklooksygenazy-2/COX-2 i indukowalnej syntazy tlenku azotu/iNOS). UC jest zwykle związane ze znacznymi defektami w nabłonku jelitowym (zmniejszenie pokrywającej warstwy śluzowej i połączeń ścisłych), ale nie jest jasne, czy obserwowane zmiany nabłonkowe są przyczyną czy konsekwencją UC. BUD promował naprawę błony śluzowej jelita/gojenie błony śluzowej w szczurzych modelach UC (generowanych przy użyciu czynnika haptenizującego oksazolonu), a także u pacjentów z UC.

W mikroskopowym zapaleniu jelita grubego (MC), przewlekłym zaburzeniu jelitowym, które wpływa na funkcję okrężnicy, jest częstsze u kobiet niż u mężczyzn (stosunek kobiet do mężczyzn 2:1), ma częstość występowania 0,6-16 przypadków na 100 000 osób/rok i zwykle manifestuje się u osób w wieku 60-65 lat, próbki biopsji pobrane z różnych części okrężnicy są niezbędne do prawidłowego rozpoznania MC. Opisano dwa podtypy histologiczne MC: zapalenie limfocytowe okrężnicy, które charakteryzuje się ponad 20 limfocytami śródnabłonkowymi na 100 komórek nabłonkowych, oraz zapalenie kolagenowe okrężnicy, które charakteryzuje się podobnym wzrostem infiltracji limfoplazmocytowej do blaszki właściwej i jest związane z pogrubionym podnabłonkowym pasmem kolagenowym (grubość, >10 µm). Zgodnie z wynikami kilku randomizowanych badań kontrolowanych, BUD jest skutecznym środkiem do leczenia MC, gdy jest podawany w dawkach 9 mg/dzień i 6 mg/dzień odpowiednio dla indukcji i utrzymania remisji klinicznej. W odniesieniu do mechanizmów leżących u podstaw, leczenie BUD zmieniało ekspresję genów zaangażowanych w metabolizm kolagenu, organizację macierzy pozakomórkowej, adhezję komórka-komórka i metabolizm energetyczny, a co najważniejsze, odgrywało rolę w przywracaniu architektury/funkcji nabłonka. Ponadto, długotrwałe stosowanie BUD jest dobrze tolerowane i ma ograniczone działania niepożądane, co czyni go realną opcją leczenia MC.

Podawanie BUD poprzez inhalację (180 do 360 μg poprzez inhalację doustną dwa razy dziennie) jest stosowane do leczenia łagodnej do umiarkowanej przetrwałej astmy od wczesnych lat 80. U pacjentów z astmą błona śluzowa dróg oddechowych traci swoją integralność w wyniku indukcji przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego (EMT) i zwiększonego zwłóknienia (błony podstawnej). Co ciekawe, podobne zmiany w strukturze nabłonka obserwuje się u dzieci z astmą nawet przed klinicznymi manifestacjami choroby i przy braku stanu zapalnego. Obserwacje te potwierdzają ideę, że przebudowa nabłonka jest przyczyną, a nie konsekwencją, przewlekłego stanu zapalnego u pacjentów z astmą. Co ważne, analiza zapalnych chorób dróg oddechowych wykazała, że BUD ma podobny efekt re-epitelializacji w tych chorobach.

Czy BUD przeciwdziała progresji nowotworów?

Plastyczność komórek przyczynia się do rozwoju tkanki i homeostazy w organizmach wielokomórkowych oraz do progresji patologii, takich jak przerzutowy rak i zwłóknienie narządów. Pojawiające się dowody ujawniły, że BUD zmniejsza plastyczność komórek (tj. ruchliwość i inwazyjność) w komórkach macierzystych i nowotworowych, w tym w komórkach raka płuc, piersi i trzustki.

W testach sferoidów nowotworowych i komór Boydena, BUD (10-20 μM) hamował migrację, ale nie proliferację, ludzkich komórek A549 (pęcherzykowych typu II), modelu komórkowego raka płuc. Kompleksowe zrozumienie mechanizmów molekularnych zmienionych przez BUD w komórkach A549 jest niewystarczające, ale istnieją pewne dowody sugerujące związek między zachowaniem ruchliwym/fenotypem mezenchymalnym a syntezą kolagenu. To znaczy, BUD hamował syntezę i dojrzewanie kolagenu na poziomie RNA i białka. Ponadto, badacze wygenerowali linie komórkowe pochodzące z A549 wyrażające niskie poziomy enzymu 4-prolilo-hydroksylacji kolagenu (P4HA2^KD) poprzez infekcję lentiwirusową shRNA. Co godne uwagi, zmniejszona ekspresja enzymu P4HA2 znacząco zmniejszała zarówno akumulację hydroksylowanego kolagenu (~10 razy), jak i migrację komórek (z 80% do 20%), bez zmiany proliferacji komórek A549.

BUD blokował inwazję komórek i rozprzestrzenianie się przerzutów linii komórkowej potrójnie negatywnego raka piersi SUM159 zarówno w warunkach in vitro (w hodowli organotypowej 3D), jak i in vivo (w ortotopowo wstrzykiwanym modelu mysim). Komórki SUM159 są fenotypowo metastabilne/heterogenne i są w stanie przejść inwazję zbiorową, typową cechę ludzkich komórek raka piersi. BUD zmniejszał zdolność inwazyjną sferoidów SUM159 i zwiększał kompakcję kolonii oraz tworzenie kolonii o okrągłym kształcie (kolistość) w sposób zależny od dawki, bez wpływu na proliferację komórek. Autorzy potwierdzili wyniki in vitro w eksperymentalnym przerzutowym modelu mysim, który został wygenerowany przez wstrzyknięcie komórek SUM159 wyrażających lucyferazę do poduszeczki tłuszczowej sutki myszy z obniżoną odpornością. Leczenie BUD tych myszy spowodowało zmniejszenie rozmiaru i objętości guza pierwotnego, a ich histologia, w tym organizacja kolagenolityczna zrębu, wykazuje mniej zorganizowaną macierz pozakomórkową otaczającą kolagen. Co godne uwagi, BUD znosi tworzenie ognisk przerzutowych w płucach.

W komórach Boydena i testach inwadopodiów Cy3-żelatyny (ustawienia wzrostu 2D), BUD (suplementowany w 20 μM) modyfikował zachowanie komórek gruczolakoraka trzustki (PDAC) poprzez zmniejszenie ich mezenchymalnych cech ruchliwych/inwazyjnych. W przeciwieństwie do BUD, inne glikokortykosteroidy, takie jak flutykazon, deksametazon i hydrokortyzon, nie były w stanie zmodyfikować fenotypu różnych linii komórkowych PDAC hodowanych w 2D, gdy były używane w podobnym zakresie stężeń. Chociaż nie oceniano wyższych stężeń GC, analiza linii komórkowej wyrażającej niskie poziomy GR (komórki PDAC z knockdownem NR3C1) wykluczyła rolę osi hormon-GR w indukowanej przez BUD epitelizacji komórek PDAC. W bardziej fizjologicznym środowisku 3D, takim jak sferoidy 3D lub hodowle organotypowe (Matrigel), komórki PDAC podlegały globalnej reprogramacji metabolicznej obejmującej metabolizm energetyczny. W wyniku tych zmian komórki PDAC stawały się coraz bardziej zależne od glikolizy w celu uzyskania energii i były uwrażliwione na nieoczekiwane antyproliferacyjne działanie GC, w tym BUD, deksametazonu i hydrokortyzonu. Ponadto, BUD hamował proliferację komórek PDAC nawet przy niskich (w skali nM) stężeniach, w sposób zależny od GR i, przynajmniej częściowo, poprzez indukcję supresora guza inhibitora kinazy zależnej od cykliny 1C (CDKN1C). Co godne uwagi, niższa częstość występowania PDAC została opisana u osób z ciężką i długotrwałą astmą, a terapią pierwszego rzutu w leczeniu astmy jest budesonid.

Jak BUD wpływa na adhezję komórkową i pluripotencję?

Adhezyjne interakcje komórka-komórka są ważnymi czynnikami w zachowaniu komórek i zależą od białek zaangażowanych w tworzenie połączeń ścisłych i adhezyjnych, takich jak klaudyny i kadheryny. Na przykład, w komórkach macierzystych, indukcja genu CDH1 (kodującego E-kadherynę) jest kluczowa dla utrzymania naiwnego/podstawowego stanu pluripotencji, podczas gdy jej regulacja w dół jest niezbędna dla wyjścia z pluripotencji, różnicowania komórek i rozwoju zarodka/tkanki. E-kadheryna jest również wymagana do utrzymania integralności/aktywności bariery nabłonkowej w różnych typach tkanek śluzowych. Wpływ BUD na plastyczność komórek jest zapośredniczony przez jego wpływ na te białka, ponieważ pojawiające się dowody sugerują, że BUD zachowuje wysokie poziomy ekspresji białek adhezyjnych na interfejsach komórka-komórka w różnych modelach komórek macierzystych i somatycznych.

Koktajl zawierający cytokiny LIF, CHIR99021 i PD032590 jest używany do utrzymania naiwnego stanu podstawowego pluripotencji w mysich komórkach ESC. Gdy komórki ESC w stanie naiwnym są inkubowane przez 3-5 dni w medium proliferacji komórek, tworzą wysoce skompaktowane kolonie komórek wyrażających E-kadherynę, wykazujące typowy okrągły kształt 3D/kopułowy. Gdy czynniki indukujące stan naiwny są usuwane z medium, komórki macierzyste przechodzą spontaniczne różnicowanie (wyjście z pluripotencji), wykazują zmienione zachowanie wzrostowe i generują nieregularne kolonie komórkowe 2D/płaskie, które są otoczone przez komórki swobodnie ruchliwe. E-kadheryna, która jest niezbędna do zachowania zarówno skłonności do agregacji, jak i naiwnej pluripotencji, jest regulowana w dół podczas spontanicznego różnicowania komórek macierzystych. BUD (w zakresie stężeń 5-20 μM) i kilka analogów BUD opóźniało wyjście z pluripotencji na poziomie morfologicznym i molekularnym poprzez stabilizację E-kadheryny na błonie komórkowej. Co godne uwagi, BUD sam, w nieobecności czynników indukujących stan naiwny, zachowuje zarówno wysokie poziomy ekspresji czynników transkrypcyjnych związanych z pluripotencją (np. OCT4, Nanog i SOX2), jak i morfologię kolonii komórkowej o kształcie kopuły podobnej do naiwnej.

W obecności nieistotnego aminokwasu proliny (w zakresie stężeń 150-250 μM) i niskich poziomów kwasu askorbinowego (VitC), mysie komórki ESC są przechwytywane we wczesnym stanie wstępnym pluripotencji. Suplementacja proliną indukuje delokalizację E-kadheryny z błony cytoplazmatycznej do pęcherzyków trans-Golgiego w cytoplazmie komórki i, w ten sposób, rozłączenie/poluzowanie/odłączenie komórek. Nieobciążony screening fenotypowy oparty na ~1200 lekach zatwierdzonych przez FDA ujawnił, że BUD był potężnym inhibitorem działania proliny w komórkach ESC. W przeciwieństwie do 24 innych glikokortykosteroidów, które zostały przebadane (w tym hydrokortyzonu i deksametazonu), BUD (gdy był podawany w dawce 10 μM) stabilizował E-kadherynę w przestrzeni międzykomórkowej i, w ten sposób, zapobiegał efektowi proliny, który polega na modulacji kilku szlaków sygnałowych, w tym szlaków AAR/ATF4 (odpowiedź na stres aminokwasowy), Wingless i Int-1 (WNT/β-katenina), czynnika wzrostu fibroblastów/kinazy regulowanej zewnątrzkomórkowo (FGF/ERK) i TGFβ.

Czy stabilizacja E-kadheryny to klucz do regeneracji nabłonka?

E-kadheryna jest niezbędna do zachowania struktury i funkcji błony śluzowej jelita. Zgodnie z tym, geny zaangażowane w funkcję bariery śluzówkowej, a mianowicie CDH1 (E-kadheryna), ECM1 (białko macierzy pozakomórkowej 1) i LMNB1 (glikoproteina macierzy pozakomórkowej laminina B1), są związane z ryzykiem UC u ludzi. Co ważne, delokalizacja błonowo-cytoplazmatyczna E-kadheryny z powodu polimorfizmów CDH1 jest uważana za jedną z głównych przyczyn niewydolności nabłonkowej w chorobie Leśniowskiego-Crohna. Zgodnie z tym, przeciwciała monoklonalne zdolne do stabilizacji kompleksu E-kadheryny wzmacniały adhezje komórka-komórka i utrudniały progresję zapalnej choroby jelit u myszy. Tak więc, indukcja i stabilizacja E-kadheryny w błonie komórkowej jest potencjalną strategią zarządzania przewlekłym zapaleniem okrężnicy. Co godne uwagi, w mysim modelu zapalenia okrężnicy wywołanego przez doodbytnicze podanie kwasu octowego, leczenie BUD normalizowało ekspresję E-kadheryny i adhezję komórka-komórka. Tak więc, efekt terapeutyczny BUD w chorobach błony śluzowej żołądkowo-jelitowej może obejmować mechanizmy re-epitelializacji wywierane poprzez normalizację ekspresji E-kadheryny i adhezji komórka-komórka.

E-kadheryna jest niezbędna do zachowania struktury i funkcji błony śluzowej dróg oddechowych. Rzeczywiście, nabłonek dróg oddechowych u pacjentów z astmą charakteryzuje się zmniejszoną ekspresją wielu cząsteczek adhezji międzykomórkowej, w tym E-kadheryny, co skutkuje upośledzoną funkcją bariery i zwiększoną inwazją przez zewnętrzne patogeny i alergeny.

Czy BUD modyfikuje epigenom w terapii chorób zapalnych?

Wpływ BUD na profil epigenetyczny komórek zyskuje na znaczeniu w wyniku trwającego badania klinicznego zarządzanego przez University of British Columbia (numer rejestracji badania NCT04342039) w Kanadzie, zatytułowanego “Epigenetyczne korzyści zdrowotne BUD”, którego zakończenie planowane jest na grudzień 2024 roku. Badanie to ma na celu przetestowanie zdolności BUD do odwrócenia modyfikacji epigenetycznych wywołanych przez alergeny i zanieczyszczenia u pacjentów z nieżytem nosa, alergiczną chorobą zapalną. Wcześniejsze badania wykazały te modyfikacje epigenetyczne w kontekście różnych nowotworów i stanów zapalnych, a także komórek macierzystych.

W komórkach macierzystych poddanych reżimowi wysokiej proliny/niskiego VitC, poziom 5-hydroksymetylocytozyny, który skłania do demetylacji DNA, szybko spada. Jednak ta redukcja nie występuje w komórkach ESC z deficytem enzymu hydroksylacji/dojrzewania kolagenu P4HA. Co ważne, BUD naśladował antagonistyczny efekt reżimu wysokiego VitC i zapobiegał zarówno zależnemu od proliny esMT, jak i wzrostowi poziomów metylacji DNA. Wczesne badania ujawniły chemoprofilaktyczne działanie BUD w karcynogenezie płuc i indukowany przez BUD wzrost metylacji DNA w komórkach raka płuc. BUD opóźniał pojawienie się guzów płuc lub ich progresję do raka w nowotworach mysich i ludzkich. Na przykład, podwójnie ślepe randomizowane badanie (badanie nr NCT00321893) pokazuje, że inhalacja BUD (800 µg dwa razy dziennie przez 1 rok) zmniejsza rozmiar niesolidnych guzków płucnych u ludzi z wysokim ryzykiem, nawet przez 5 lat obserwacji. Ponadto, w mysich modelach raka płuc, leczenie BUD (2 mg/kg podawane doustnie jako część diety) zmniejszało rozmiar litych gruczolaków płuc wywołanych przez karbaminian winylowy (podawany dootrzewnowo w dawce 16 mg/kg). Chociaż mechanizmy leżące u podstaw tych działań BUD nie są całkowicie jasne, spekuluje się, że zmiany w profilu epigenetycznym komórek mogą być zaangażowane. Rzeczywiście, przyjmowanie BUD (dodanego do diety w dawce 0,6 do 2,4 mg/kg) przez 7 dni zwiększało całkowity poziom metylacji DNA (na podstawie analizy dot blot) guzów płuc u myszy. W szczególności, BUD indukuje metylację wysp CpG związanych z dwoma genami związanymi z nowotworami, mianowicie insulinopodobnym czynnikiem wzrostu 2 (IGF-2) i onkogenem komórkowym mielocytomatozy (c-MYC). W linii komórkowej AA8 (fibroblasty jajnika chomika) eksponowanej (24 h) na wysokodawkowy reżim BUD (10-70 μM), poziom globalnej metylacji DNA (na podstawie pomiarów poziomów 5-metycytozyny za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej) zwiększał się w sposób zależny od dawki. Jednak szlaki, poprzez które BUD wpływa na poziomy metylacji DNA, pozostają niejasne. Niedawny przegląd wskazał, że BUD może funkcjonować jako aktywator metylotransferaz DNA, ale brakuje eksperymentalnych dowodów na bezpośrednią interakcję między BUD a metylotransferazami DNA.

Czy BUD wspiera walkę z infekcjami wirusowymi?

Wziewne kortykosteroidy tłumią zapalenie błony śluzowej u pacjentów z przewlekłymi chorobami zapalnymi, takimi jak astma, poprzez regulację w dół ekspresji genów zapalnych. Jednym z mechanizmów, które są aktywowane w celu wyłączenia transkrypcji genów zapalnych, jest zmniejszenie poziomów acetylacji histonów poprzez rekrutację deacetylazy histonów 2 (HDAC2). Zgodnie z tym, zgłoszono, że oporność na steroidy, która jest niezdolnością steroidów do zmniejszenia stanu zapalnego płuc, jest związana z osią Nrf2-HDAC2. Na przykład, BUD hamuje zapalenie płuc indukowane lipopolisacharydem u normalnych myszy, ale nie u myszy pozbawionych ekspresji HDAC2. Hipometylacja DNA indukowana przez BUD mogłaby indukować wiązanie deacetylaz histonów (enzymy HDAC), zmniejszając w ten sposób poziomy acetylacji histonów, zwiększając kondensację chromatyny i, w ten sposób, hamując ekspresję genów.

BUD wykazuje zdolność do hamowania infekcji i/lub replikacji różnych jednoniciowych (+ssRNA lub (+)RNA) wirusów RNA infekujących ludzi, w tym koronawirusa 2 wywołującego ciężki ostry zespół oddechowy (SARS-CoV-2), rinowirusa (HRV), ludzkiego koronawirusa (HCoV) i zespołu oddechowego Bliskiego Wschodu (MERS).

Korzystny wpływ leczenia BUD na wczesną chorobę COVID-19 wyłonił się z kilku randomizowanych badań i meta-analizy. Poprzez swoje działanie jako przeciwzapalny glikokortykosteroid, BUD zapobiegał burzy cytokinowej, która jest obserwowana u niektórych pacjentów z COVID-19, tj. nadmiernej odpowiedzi immunologicznej związanej z niewydolnością wielonarządową i zgonami. W badaniach in vitro wykazano, że BUD hamuje zakażenie SARS-CoV-2 hodowanych komórek VeroE6 w sposób zależny od dawki (gdy jest podawany w dawkach od 0,1 do 25 µM) i jest skuteczny przeciwko kilku wariantom wirusa przy IC50 5-20 μM. Jeśli chodzi o związane z tym mechanizmy, stwierdzono, że BUD zmniejsza ekspresję receptora SARS-CoV-2, enzymu konwertującego angiotensynę-2 (ACE2), w sposób zależny od interferonu beta typu I (IFN-β). Może to tłumić wejście wirusa SARS-CoV-2 do komórek. Co godne uwagi, ACE2 reguluje również transport błonowy transportera neutralnych aminokwasów SLC6A19, transportera proliny zależnego od sodu i niezależnego od chlorków. Ta obserwacja mogłaby wyjaśnić, przynajmniej częściowo, w jaki sposób BUD przeciwdziała zdolności suplementacyjnej proliny do indukowania esMT w mysich komórkach ESC.

HRV powodują przeziębienie. Screening 800 leków zatwierdzonych przez FDA ujawnił, że BUD hamuje cytotoksyczność zapośredniczoną przez HRV w komórkach HeLa. BUD (10 nM) hamował również zakażenie HRV w pierwotnych hodowlach ludzkich komórek nabłonkowych tchawicy. Zmniejszenie ekspresji genu cząsteczki adhezji międzykomórkowej-1 (ICAM-1), kodującego receptor HRV, mogło przyczynić się do tego działania BUD. Ponadto, jako klasyczny glikokortykosteroid, BUD (1 μM) zapobiega indukowanej przez HRV indukcji potężnej cytokiny zapalnej pro-interleukiny-1beta (IL-1β) w mysich makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego, a także translokacji z cytoplazmy do jądra czynnika jądrowego kappa-B (NF-kB) i ekspresji IL-1β, IL-6 i IL-8 w ludzkich komórkach nabłonkowych tchawicy.

Wirus HCoV infekuje komórki gospodarza poprzez wiązanie się z receptorem aminopeptydazy N (APN), a HCoV-229E invaduje komórki poprzez oś receptor APN-endosom. BUD, w połączeniu z glikopironium i formoterolem, hamował zakażenie HCoV-229E (czynnik etiologiczny przeziębienia) pierwotnych ludzkich komórek nabłonkowych nosa i tchawicy. Podczas gdy molekularny mechanizm leżący u podstaw hamowania HCoV pozostaje nieznany, regulacja w dół ekspresji APN i hamowanie funkcji endosomalnej mogą być zaangażowane.

Wirus MERS-CoV wchodzi do komórki gospodarza poprzez wiązanie się z receptorem dipeptydylopeptydazy IV (DPP4). Cyklezonid, steroid o strukturze pentacyklicznej obejmującej pozycje 16 i 17 szkieletu steroidowego, hamuje replikację MERS-CoV i SARS-CoV-2 w komórkach VeroE6 i okazał się bardziej wydajny niż BUD. Ponadto, cyklezonid i BUD mogą celować w kompleks replikacyjno-transkrypcyjny wirusa w zróżnicowanych ludzkich komórkach nabłonkowych oskrzeli tchawicy. Jednak w podobnych warunkach, kortyzon, deksametazon i flutykazon nie są w stanie zahamować replikacji tego wirusa.

BUD został przetestowany w komórkowym modelu zaburzenia bariery nabłonkowej dróg oddechowych wywołanego przez wirusa, tj. monowarstwie ludzkich komórek nabłonkowych oskrzeli (16HBE) eksponowanych na dsRNA/poly(l:C). Wyniki wykazały, że leczenie BUD ograniczało transepitelialny opór elektryczny i przepuszczalność małych cząsteczek (zgodnie z wynikami eksperymentów przepływu 4 kDa FITC-dekstranu). Ponadto, BUD okazał się również skuteczny przeciwko zaburzeniom bariery dróg oddechowych wywołanym przez poly(l:C) w płucach myszy, niezależnie od jego działania przeciwzapalnego. Zaobserwowano, że BUD może być włączony do błon komórkowych i, podobnie jak cholesterol, może zmieniać płynność błon komórkowych. Co godne uwagi, generowanie wewnątrzkomórkowych pęcherzyków z podwójną błoną jest niezbędne dla replikacji (+)RNA wirusów RNA infekujących ludzi.

Jakie mechanizmy działania BUD pozostają nadal nieodkryte?

Jak opisano w poprzednich sekcjach, na podstawie ostatnich dowodów, jest teraz jasne, że BUD ma wpływ na kilka różnych typów komórek innych niż komórki odpornościowe. Jednak poza GR, receptor/cząsteczka(i) docelowa(e) BUD pozostaje(ą) nieznana(e). BUD, podobnie jak cholesterol i sterole, jest włączany do błon komórkowych, a znacząca frakcja (~80%) jest szybko przekształcana (~20 min) w lipofilne estry kwasów tłuszczowych (poprzez estryfikację z palmitynianem lub oleinianem w pozycji C-21). Ponieważ estry kwasów tłuszczowych mogą być hydrolizowane (odwracalna estryfikacja) przez wewnątrzkomórkowe lipazy, koniugaty BUD są uważane za wewnątrzkomórkową pulę/rezerwę leku, które są przydatne do przedłużenia jego działania przeciwzapalnego. Jednak wpływ BUD lub koniugatów BUD na aktywności związane z błoną plazmatyczną, tj. sygnalizację, przepuszczalność komórek, recykling endosomów oraz konformację cytoszkieletu/morfologię jądra komórkowego, pozostaje niezbadany. Co godne uwagi, BUD mógłby wpływać na skład/właściwości biofizyczne (tj. płynność i sztywność) mikrodomen tratwowych wzbogaconych w cholesterol i sfingolipidy, które są kluczowymi graczami w modulacji wielu istotnych szlaków sygnalizacyjnych komórkowych. Rzeczywiście, efekt interakcji BUD-błona na właściwości komórek zasługuje na dalsze badania. W szczególności, porównanie wpływu BUD na transkryptom, epigenom i metabolom linii komórkowych GR+ i GR- mogłoby być bardzo przydatne do zrozumienia, które procesy są regulowane przez BUD niezależnie od GR.

Pojawiające się dowody wskazują, że procesy komórkowe/molekularne, na które działa BUD w celu skutecznego zmniejszenia objawów/progresji chorób zapalnych, są złożone i nadal nie w pełni zrozumiane. Rzeczywiście, błona śluzowa różnych traktów żołądkowo-jelitowych (przełyk, żołądek i jelito) i dróg oddechowych (krtań, oskrzela i płuca) różni się pod względem organizacji histologicznej oraz typów i liczby warstw nabłonkowych. Jednak wspólną cechą różnych tkanek śluzowych jest generowanie i utrzymywanie silnych interakcji komórka-komórka, co zapewnia aktywność bariery, tj. izolację narządów wewnętrznych od zewnętrznych mikrobów i/lub toksyn (chemikaliów, alergenów), a także precyzyjnie regulowaną wymianę jonów i wody. Tutaj proponujemy, że zmniejszenie adhezyjnych kontaktów międzykomórkowych jest wydarzeniem wyzwalającym w patogenezie chorób zapalnych, po którym następuje infiltracja mikrobów/toksyn i, ostatecznie, aktywacja i transmigracja komórek odpornościowych (eozynofilów, limfocytów i makrofagów) do błony śluzowej. Ponadto, jak wykazano w literaturze, deregulacja genów związanych z nabłonkiem i przebudowa macierzy pozakomórkowej są związane z różnymi chorobami zapalnymi. W tym scenariuszu BUD może wspierać “re-epitelializację” (regenerację błony śluzowej) obrzękniętej błony śluzowej na co najmniej dwa różne sposoby: (1) poprzez hamowanie aktywacji/transmigracji komórek odpornościowych oraz (2) poprzez modulację ekspresji/aktywności genów zaangażowanych w interakcje komórka-komórka, sprzyjając w ten sposób stabilizacji nabłonka i przywróceniu jego aktywności barierowej.

Niedawne badania podkreśliły związek między szczególnym działaniem epitelizacyjnym BUD a stabilizacją adhezyjnego białka E-kadheryny w przestrzeniach międzykomórkowych. Rzeczywiście, trzy modele wyjścia z pluripotencji w komórkach macierzystych zarodkowych, w tym rozwój gastruloidów i przejście zarodkowych komórek macierzystych do mezenchymalnych, sugerują istnienie precyzyjnie regulowanej osi BUD-E-kadheryna-pluripotencja. Ekspresja E-kadheryny jest indukowana przez aktywację szlaku sygnałowego WNT, a agonista WNT jest wymagany do indukcji wydłużenia/rozwoju gastruloidów. Może to oznaczać, że BUD, bezpośrednio lub pośrednio, kontroluje lokalizację w błonie komórkowej i/lub aktywność adhezyjną E-kadheryny. Godne uwagi w tym względzie jest to, że ekspresja E-kadheryny jest indukowana i może zastąpić OCT4 podczas przeprogramowania komórek somatycznych w kierunku indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych. Jednak nie jest jasne, czy BUD ma przypuszczalny korzystny wpływ na przeprogramowanie komórek somatycznych, i jest to temat, który wymaga zbadania w przyszłości.

Jakie mechanizmy działania BUD pozostają nadal nieodkryte?

Adhezyjne interakcje komórka-komórka zapośredniczone przez E-kadherynę są również ważne w biologii komórek nowotworowych. Na przykład, E-kadheryna jest wymagana do generowania przylgających skupisk komórek nowotworowych, które przechodzą zbiorową migrację komórek. Ponadto, delokalizacja E-kadheryny (z błony komórkowej do cytoplazmy) jest związana z nabyciem fenotypu mezenchymalnego/swobodnie ruchliwego. Zgodnie z tym, BUD stabilizował interakcje komórka-komórka zapośredniczone przez E-kadherynę i zmniejszał cechy mezenchymalne w komórkach raka piersi, płuc i trzustki. Dodatkowe dogłębne badania byłyby wymagane do zrozumienia szlaków, poprzez które BUD celuje w sygnalizację E-kadheryny. W tym względzie, interakcje komórka-komórka mogą być wzmocnione poprzez wykorzystanie zwiększonego powinowactwa wiązania klastrów kadheryny w porównaniu z monomerami kadheryny. Ponadto, tratwy lipidowe i białka związane z tratwami lipidowymi mogą być kluczowe dla organizacji klastrów kadheryny. Tak więc, może być interesujące zbadanie istnienia osi BUD-mikrodomena tratwowa-klaster E-kadheryny. Spekulujemy, że podobny mechanizm działania może być również zaangażowany w gojenie zapalnej błony śluzowej indukowane przez BUD i przyczyniać się do remisji chorób zapalnych. Ponadto, związki bioaktywne pochodzące z BUD, które byłyby w stanie wywołać podobne efekty, ale z większą potencją, są prawdopodobnie potencjalnymi kandydatami na leki do leczenia szerokiego spektrum chorób obejmujących mezenchymalizację komórek, takich jak progresja/przerzuty raka.

Molekularne mechanizmy leżące u podstaw hamowania infekcji/replikacji wirusa zapośredniczonego przez BUD pozostają nieznane. Chociaż wirusy, które BUD hamuje, są wszystkie wirusami RNA o dodatniej polarności jednoniciowego RNA, zaangażowane receptory pozakomórkowe są różne (ACE2, APN, ICAM-1 i DPP4). Pomimo tego, nie można wykluczyć zaangażowania interakcji BUD-błona cytoplazmatyczna w recykling receptora wirusa (ruch endosomalny). Ponieważ genomy wirusów (+)RNA mają zdolność do działania jako RNA informacyjny, ich genomy są bezpośrednio tłumaczone na białka przez rybosomy gospodarza. Gdy białka wirusowe są produkowane wewnątrz gospodarza, rekrutują RNA do produkcji wirusowych kompleksów replikacyjnych. W ten sposób replikacja wirusowa kontynuuje się poprzez pośredniki dwuniciowego RNA. Hamowanie replikacji wirusowej, gdy transport cholesterolu jest blokowany, sugeruje, że te dynamiczne zmiany w transporcie są funkcjonalnie istotne dla wirusa. Tak więc, BUD mógłby zmieniać płynność/właściwości błony, które są wymagane dla wydajnej replikacji wirusowej, i to zasługuje na dalsze badania.

Podsumowując, wielokierunkowe efekty BUD w różnych kontekstach chorobowych, w tym chorobach zapalnych, nowotworach i infekcjach wirusowych, czynią go potężnym środkiem terapeutycznym, który mógłby mieć ogromny potencjał, jeśli byłby używany w połączeniu z innymi lekami. Przyszłe dogłębne badania nad jego mechanizmami mogłyby zapewnić bogatsze zrozumienie molekularnego krajobrazu tych stanów i rzucić światło na bardziej skuteczne strategie terapeutyczne, w tym BUD.

Podsumowanie

Budesonid (BUD) to syntetyczny glikokortykosteroid o unikalnej strukturze pentacyklicznej, który wykazuje silne działanie przeciwzapalne przy minimalnych efektach ogólnoustrojowych. Jego wyjątkowe właściwości farmakokinetyczne, w tym ekstensywny metabolizm wątrobowy i niską biodostępność, czynią go bezpiecznym lekiem pierwszego wyboru w terapii wielu chorób zapalnych. BUD wykazuje skuteczność w leczeniu schorzeń układu oddechowego oraz przewodu pokarmowego poprzez stabilizację bariery nabłonkowej i modulację odpowiedzi immunologicznej. Najnowsze badania wskazują na jego dodatkowe właściwości – hamuje plastyczność komórek nowotworowych i ich zdolność do przerzutowania oraz wykazuje działanie przeciwwirusowe wobec wirusów RNA, w tym SARS-CoV-2. Kluczowym mechanizmem działania BUD jest stabilizacja E-kadheryny i wzmacnianie połączeń międzykomórkowych, co przyczynia się do regeneracji nabłonka i przywrócenia jego funkcji barierowej. Pomimo szerokiego zastosowania klinicznego, niektóre mechanizmy molekularne działania BUD pozostają niewyjaśnione i wymagają dalszych badań.